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一、产气荚膜梭菌生物学特性

1、产气荚膜梭菌的生物学特性

▶ 生物学特性：产气荚膜梭菌属于厚壁菌门梭菌状芽孢杆菌类属，革兰氏阳性粗短大杆菌，有时可见芽孢体，有荚膜，无鞭毛，两端钝圆，单个或成双排列，偶见链状。芽孢椭圆形，位于菌体中央或次级端，芽孢直径不大于菌体，因能分解肌肉和结缔组织中的糖，产生大量气体，以及本菌在体内能形成荚膜而得名。产气荚膜梭菌为非专性厌氧菌，在加葡萄糖，血液的普通培养基上生长良好。

▶ 流行学特征：产气荚膜梭菌是引起食源性肠胃炎最常见的病原之一，可引起典型的食物中毒爆发。产气荚膜梭菌导致的食物中毒多与肉制品相关，产气荚膜梭菌肠毒素CPE是引起食物中毒的致病因子。按毒素种类，产气荚膜梭菌分为A、B、C、D、E 5个型，与人类致病相关的为A、C型，其中A型产气荚膜梭菌是类气性坏疽（外伤感染）和食物中毒的主要病源菌。由于在食品中该菌数量必须达到很高时（10的7次方或更多），才能在肠道中产生毒素，因此其计数结果是比较关键的。

2、产气荚膜梭菌的形态染色

▶ 产气荚膜梭菌的典型形态呈杆状，直径0.9～1.3×3 ～ 9µm，常单独散在，无鞭毛。

▶ 革兰氏染色阳性杆菌，有时可见芽孢体，有荚膜，无鞭毛，两端钝圆，单个或成双排列，偶见链状。芽孢椭圆形，位于菌体中央或次级端。

▶ 芽孢染色菌体红色，芽孢绿色。

3、产气荚膜梭菌其他特性

▶ 在庖肉培养基中培养后使肉汤轻度浑浊，产生大量气体。

▶ 非专性厌氧。

▶ 在血平板上会出现β溶血环，并出现双溶血带。

▶ 能发酵乳糖，葡萄糖，麦芽糖，棉籽糖，不发酵木糖，鼠李糖。能液化明胶和产生卵磷脂酶（α毒素）。

二、产气荚膜梭菌检验方法

1、产气荚膜梭菌的检验流程

2、产气荚膜梭菌的样品制备

▶ 样品采集后应尽快检验，若不能及时检验，可在2 ℃-5 ℃保存；如8 h内不能进行检验，应以无菌操作称取25 g（mL）样品加入等量缓冲甘油-氯化钠溶液（液体样品应加双料），并尽快置于-60 ℃ 低温冰箱中冷冻保存或加干冰保存。

▶ 冷冻保存及干冰保存操作目的：使待检样品保持低氧环境，防止检样中自身微生物的繁殖以及外源微生物的污染。

▶ 以无菌操作称取25 g（mL）样品放入含有225 mL 0.1%蛋白胨水（如为5.1.1 中冷冻保存样品，室温解冻后，加入200 mL 0.1%蛋白胨水）的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1 min-2 min；或置于盛有225 mL 0.1%蛋白胨水的均质杯中，8 000 r/min-10 000 r/min 均质1min-2 min，作为1:10 稀释液。

▶ 冷冻样品加200ml稀释液原因：由于冷冻样品解冻后重量会有所增加。    

▶ 以上述1:10 稀释液按1 mL 加0.1%蛋白胨水9 mL 制备10^-2到10^-6 的系列稀释液。   

▶ 稀释建议：样品做梯度稀释时，每个稀释度要更换吸管，否则会造成定量结果偏高。

3、产气荚膜梭菌的分离培养

▶ 吸取各稀释液1 mL 加入无菌平皿内，每个稀释度做两个平行。每个平皿倾注冷却至50 ℃的TSC琼脂（可放置于50 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）15 mL，缓慢旋转平皿，使稀释液和琼脂充分混匀。

▶ 上述琼脂平板凝固后，再加10 mL 冷却至50 ℃的TSC琼脂（可放置于50 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）均匀覆盖平板表层。待琼脂凝固后，正置于厌氧培养装置内，36 ℃±1 ℃培养20 h～24 h。

▶ 典型的产气荚膜梭菌在TSC琼脂平板上为黑色菌落。   

4、培养基原理解析

1）、胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂

▶ 胰胨、大豆大白胨和酵母粉提供氮源、维生素和生长因子；葡萄糖和乳糖为可发酵糖类提供碳源；偏亚硫酸氢钠和柠檬酸铁铵用于检测硫化氢的产生，使菌落中心呈黑色；卵黄含有卵磷脂，可检测某些含卵磷脂酶的梭菌；D-环丝氨酸抑制非梭菌的细菌；琼脂是培养基凝固剂。

▶ 产气荚膜梭菌的菌落形态：偏亚硫酸氢钠和柠檬酸铁铵可检测到H₂S，使菌体颜色呈黑色。倾注法能有效避免H₂S因挥发导致菌落黑色消失。 

TSC琼脂（产气荚膜梭菌ATCC13124，黑色菌落）

2）、产气荚膜梭菌的纯培养

▶ 从单个平板上任选5个（小于5个全选）黑色菌落，分别接种到FTG培养基， 36 ℃±1 ℃培养18h～24 h。

▶ FTG培养基培养后状态：氧化层以下浑浊或者成条状生长。   

3）、产气荚膜梭菌的确证试验 — 牛奶暴烈发酵

▶ 取生长旺盛的FTG 培养液1 mL 接种于含铁牛乳培养基，在46 ℃±0.5 ℃水浴中培养2 h 后，每小时观察一次有无“暴烈发酵”现象，该现象的特点是乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质，通常会上升到培养基表面。5 h 内不发酵者为阴性。产气荚膜梭菌发酵乳糖，凝固酪蛋白并大量产气，呈“暴烈发酵”现象，但培养基不变黑。

▶ 产气荚膜梭菌利用乳糖产酸，使牛奶中酪蛋白凝固，同时产生大量气体，将凝固的酪蛋白冲成不规则状。

▶ 试验原理：含铁牛奶中产酸使酪蛋白凝固，同时产生大量气体，将凝固的酪蛋白冲散，并将培养基冲至瓶口处，呈现“爆裂发酵” 的现象。

▶ 注意事项：进行暴烈牛乳发酵实验时，含铁牛乳培养基采用加热煮沸非高压灭菌方式，能有效提前暴烈发酵的时间。此外接种菌液时，菌液浓度需较高，并且接种于培养基中下部，不能接种于培养基表面；因暴烈发酵时培养基会上升，因此培养及表面到试管口应留一定空隙，防止实验过程中培养基溢出。

4）、产气荚膜梭菌的确证试验 — 动力硝酸盐试验

▶ 用接种环（针）取FTG 培养液穿刺接种缓冲动力-硝酸盐培养基，于36 ℃±1 ℃培养24 h。

▶ 有动力的菌株呈扩散生长，无动力的菌株只沿穿刺线生长。

▶ 滴加硝酸盐试剂甲、乙液以检查亚硝酸盐的存在。15 min内出现红色者，表明硝酸盐被还原为亚硝酸盐；如果不出现颜色变化，则加少许锌粉，放置10 min，出现红色者，表明该菌株不能还原硝酸盐。如果没有出现颜色，说明原菌已经将硝酸盐还原至氮气甚至铵盐。   

▶ 产气荚膜梭菌无动力，可以将硝酸盐还原成亚硝酸盐，表层红色。

产气荚膜梭菌ATCC13124

5）、产气荚膜梭菌的确证试验 — 乳糖明胶试验

▶ 用接种环（针）取FTG 培养液穿刺接种乳糖-明胶培养基，于36 ℃±1 ℃培养24 h，观察结果。

▶ 如发现产气和培养基由红变黄，表明乳糖被发酵并产酸。

▶ 典型的产气荚膜梭菌在TSC琼脂平板上为黑色菌落。

▶ 将试管于5 ℃左右放置1 h，检查明胶液化情况。如果培养基是固态，于36 ℃±1 ℃再培养24 h，重复检查明胶是否液化。   

▶ 产气荚膜梭菌能发酵乳糖，使明胶液化。   

▶ 注意事项：穿刺乳糖明胶应注意多次穿刺，保证接种量适宜。

5、产气荚膜梭菌的计算方法

▶ 吸取各稀释液1 mL 加入无菌平皿内，每个稀释度做两个平行。每个平皿倾注冷选取典型菌落数在20 CFU～200 CFU 之间的平板，计数典型菌落数。如果：

a）只有一个稀释度平板的典型菌落数在20CFU～200CFU 之间，计数该稀释度平板上的典型菌落；

b）最低稀释度平板的典型菌落数均小于20 CFU，计数该稀释度平板上的典型菌落；

c）某一稀释度平板的典型菌落数均大于200 CFU，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；

d）某一稀释度平板的典型菌落数均大于200 CFU，且下一稀释度平板上有典型菌落，但其平板上的典型菌落数不在20 CFU～200 CFU 之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落；

e）2 个连续稀释度平板的典型菌落数均在20CFU～200CFU 之间，分别计数2 个稀释度平板上的典型菌落。

T --- 样品中产气荚膜梭菌菌落数; A --- 单个平板上的典型菌落的总数; B --- 单个平板上的鉴定为阳性的菌落数; C --- 单个平板上的用于鉴定试验的菌落数; n1 --- 第一稀释度(低稀释倍数)经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数; n2 --- 第二稀释度(高稀释倍数)经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数; 0.1 --- 稀释系数; d --- 稀释因子(第一稀释度)。

6、产气荚膜梭菌的计算示例

T=183×3/5 + 176×4/5+21×4/5 +27×2/5 / { (2 +0.1×2 )0.1 } = 6322

7、产气荚膜梭菌的结果报告

▶ 根据TSC琼脂平板上产气荚膜梭菌的典型菌落数，按照6.2 中公式计算，报告每g（mL）样品中产气荚膜梭菌数，报告单位以CFU/ g（mL）表示；

▶ 如T 值为0，则以小于1 乘以最低稀释倍数报告。   

8、产气荚膜梭菌恒温荧光核酸快速检测法